CRISPR技术及应用前景

类别:行业 机构:兴业证券股份有限公司 研究员:孙媛媛/徐佳熹 日期:2020-10-19

CRISPR/Cas9技术原理

    CRISPRCas9来施,为目前发现存在于多数细菌与绝大多数的吉菌中的一种后天免疫素统,以消灭外来的质粒或者噬首体,并在自身基四组中留下外来基國片段作为"记忆”。全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白鹿统(Chustered Regularty Interspaced Sbort Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins)

    CRISPR/Cas9东统主要是由Cas9蛋白和单链导向RNA(single guide RNA,gRNA)组成其中Cas9蛋白具有切割DNA双链的功能,gRNA起导向作用,Cas9蛋白可以在geRNA的导向下通过碾基互补配对到达不同的靶部位,切割靶基因来对基因进行定点的精确编辑。CRISPRCas9定向剪切需要满足几个条件:第一,将编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列,为常见的NGG序列,PAM序列之前为可以械Cas9蛋白特异性识削并切制的序列,通常约20个碱基长

    第二,向导RNA委与PAM上游的序列确基互科配对。最基础的应用就是基國敲除。如果在基因的上下游设计一对向导RNA(ERNA1,gRNA2),将其与含有Cas9蛋白编码基园的质粒一同持入细胞中↑gRNA通过碱基互补配对可以靶向FAM附近的目标序列,Cas9蛋白会使诚基因上下游的DNA双链断裂中随后生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制,会将断裂上下游两端的序列连接起来,从而实现了细胞中日标基因的蔽除电如果在此基础上为细胞引入一个惨复的棋板质粒(DooorDNA),这样细胞就会按照提误的棋板在修复过程中引入片段辅入(Knock-mn)或定点突变(site-specif.c mtagenesis)

    这样就可以实现基因的替换或者突变。随着研究的深入,CRISPRCas技术已经楼广泛的应用,除了基國敲除↑基因替提等基确编辑方式,它还可以被用于基园激活。疾病模型构建,甚至是基國治疗

    其中,选取合适的外显于编辑片段和设计gRNA都可以通过免费的公开平台,如Pabnned,AddGene等完成。

    CRISPR/Cas9技术路径概览

    将患者血液样本中的T细胞进行分离、活化,得到待编辑的初代T细胞;

    将Cas9蛋白以及sgRNA组成RNP复合体,转染到待编辑的T细胞中进行CRISPR基因编辑;

    编辑后的T细胞进行活化、扩增,通过免疫染色、WB,TIDE测序等方式验证编辑效率;

    完成回输等操作

    此外。对于脱靶率的检测也是目前研究者关注的安全性方面最重要的问题之一,即如何检测靶向片段以外的片段也参与编辑,从而引发不可规计的安全性问题;

    目前,主要是通过全基因组的序列分析进行预测,其次还包括GUIDB-seq等测序方法;潜在的脱靶风险,以及如何评估安全性问题,将是基因编辑技术在临床治疗中面帖的主要限制问题之一。

    CRISPR在基因治疗中的应用限制及发展方向

    脱靶效应:

    尽管在了解CRISPR / Cas9系统方面取得了重大进展,但仍存在脱靶效应的担忧。

    确实,有几个研究小组在CRISPR / Cas9的活性和特异性之间进行了权衡,通过全基因组深度测序技术鉴定了脱靶DNA的剪切;

    脱靶是CRISPR应用的关注。但是,可以通过选择和优化sgRNA来降低脱靶效应。

    此外,体内脱靶检测可用于定义和量化整个生物体中核酸酶的脱靶编辑。最近开发的抗CRISPR蛋白可以有条件地控制CRISPR系统的活性, 这可能显示出减少脱靶效应的潜力;

    开发更敏感的方法对于检测基因组和转录组水平的脱靶编辑是CRISPR技术未来发展的趋势。

    CRISPR/Cas激发免疫反应:

    CRISPR / Cas系统的应用引起了对细菌衍生的Cas9蛋白的免疫原性的关注。证明抗Cas9应答存在于健康成年人中。在34个人类血液样本中,检测到针对SaCas9(样本的79%)和针对SpCas9(样本的65%)的抗Cas9 IgG抗体。

    如何减少免疫反应对CRISPR/Cas系统的影响,以及保持长期有效的表达,将是未来技术发展的方向之一。

    体内递送技术:

    AAV是CRISPR / Cas体内递送中使用最广泛的。但是,AAV的包装能力有限,阻碍了CRISPR / Cas组件的多合一递药,特别是较大的Cas衍生的基础编辑器和主要编辑器。这似的在不同的应用场景中,较小的Cas9直系同源物(如SaCas9 13)反而更加合适;

    对于HDR或基础编辑者进行的疾病纠正,可以使用双重AAV载体或拆分的AAV载体来规避包装尺寸的限制。这种方法的缺点是,需要将两个AAV载体在大约90摄氏度的吸收和表达到同一细胞中同时确保细胞内Cas9-sgRNA复合物的形成,技术难度依然较高;

    CRISPR / Cas组分也可以通过非病毒方法递送,例如,Cas9 mRNA和sgRNA可以通过纳米颗粒递送至小鼠肝脏。但是必须考虑纳米颗粒进入细胞和细胞核的外部和内部障碍。目前,携带CRISPR / Cas成分的纳米颗粒已广泛应用于小鼠并被递送至肝脏。因为肝脏中含有有孔的毛细血管内皮细胞。其他靶组织需要进一步改进基于纳米颗粒的CRISPR / Cas成分递送系统。

    DNA损伤后的自我修复:

    在通过NHEJ和HDR进行CRISPR / Cas基因编辑时,在目标位点产生DSB。研究发现基于DBS的修复激活p53依赖的DNA损伤反应并诱导短暂的细胞周期停滞,从而导致模板介导的精确基因组编辑效率降低。

    在人类多能干细胞中,p53缺陷型细胞更容易受到CRISPR介导的修饰。这些发现表明,在临床试验期间,应监测患者体内CRISPR工程改造的细胞或器官的p53功能。避免DSB触发p53介导的反应,将是未来保证安全性,精确性的要求之一。

    风险提示

    新产品研发及注册风险

    行业政策变动风险

    市场竞争格局变动风险

    专利变动风险